氣相液氮罐的應用與疾病生物樣本庫建設與管理

大數據時代加上現金最炙手可熱的細胞治療。研究者更關注樣本的生物信息數據與疾病臨床信息的相關性，通過大樣本的關聯分析，來預測疾病的發生、發展與轉歸。疾病生物樣品庫便是關聯疾病臨床信息與樣本生物信息的橋梁與核心，是生命科學基礎與臨床研究的關鍵源頭，是進行大樣本驗證、快速實現生物醫藥轉化醫學的核心環節。近幾年，我國疾病生物樣本庫與轉化醫學得到政府與科學家們的高度關注、醫院領導與專家們的高度重視、企業與技術部門大力支持，廣大科研、醫務工作者的積極響應，呈現良好發展勢頭。從樣本資源來說，中國最大的特點是樣本資源量大，資源種類多樣化。在中國一個月的就診數量，在國外達到同樣的病例數可能要幾個月，如胸腺腫瘤類，據說整個歐洲的例數甚至少于中國的一家三甲專科醫院。目前，我國生物樣本庫有專家庫、科室庫、多學科庫、重大項目庫、醫院庫、區域庫等，不少醫院（尤其三甲醫院）紛紛著手建立自己的樣本庫，其中有精品庫、價值庫、特色庫，也有不少垃圾庫、死庫。

疾病生物樣本庫建設

建設樣本庫的基本原則建樣本庫是安全、準確、便捷。其中安全包括樣本生物安全、樣本信息安全、設備運行安全；準確包括樣本信息準確、樣本存放取出位置準確；便捷包括工作流程便捷、軟件系統操作便捷、信息交流便捷、硬件軟件耗材供應及技術支持便捷。樣本庫通常由基礎設施、凍存設備——主要由氣相液氮罐構成、凍存耗材、編碼及讀碼設備、監控設備、管理軟件和人員配置構成。合理的架構及流程可以保證樣本庫運行安全、準確、便捷。

基礎設施

基礎設施一般包括質檢室、樣本處理室、冰箱室、氣相液氮罐設備室、監控室、空調設備、備份電源等。其中需要注意的是：冰箱是產熱設備，需要和液氮設備分開放置。立式冰箱如不能背靠墻擺放，可保持一定距離背對背擺放。考慮到超低溫冰箱目前仍是組織庫的主要存儲設備，在運行過程中會大量產熱，配備樣本庫空調時對其功率和性能可靠性需要給予足夠的考慮。備份電源也是樣本庫的基本配備。在供電不夠十分穩定的地區，在選擇冰箱時還要考慮到冰箱的溫度絕緣性（即滿載樣品時斷電后溫度上升的速度）。當樣本容量足夠大時，還需要考慮使用自動化取放樣品的設備。對于特別重要的樣本，條件許可的情況下可以將樣本的備份分開放置于不同的物理地點以增加安全性。

基本設備

⑴-80度凍存設備（超低溫冰箱）：超低溫冰箱穩定工作的溫度通常在-800C左右，在取放樣品的時候很容易升至-600C的再結晶溫度范圍，容易造成樣本生物穩定性的衰減。所以在選用超低溫冰箱的時候制冷能力（速度）是一個關鍵參數。制冷能力強的冰箱能夠在溫度受到擾動的，快速降至設定的溫度以盡量減少對樣本的傷害。另外，由于樣本庫的目的是長期存放樣品，超低溫冰箱需要在滿載情況下多年不間斷運行，對其可靠性和溫度穩定性都比普通實驗室的要求要高。樣本庫的冰箱需要有運行溫度的連續記錄功能，以便追蹤溫度波動。

⑵-140度凍存設備（氣相液氮罐和深冷冰箱）：氣相液氮罐和深冷冰箱是實現-1400C長期樣品儲存的常用設備。這兩種方法因為不存在液氮進入樣本內的風險，因而儲藏期間沒有樣本間交叉感染的危險。深冷冰箱是相對較新的一種設備，從近幾年的客戶使用反饋來看，在滿載樣品的情況下能夠實現-140~-1500C的穩定環境，得到了越來越多的應用。氣相液氮罐是更受廣泛認可的方法，美國國家癌癥協會等機構的樣本庫操作規范文件中均推薦使用氣相液氮罐長期儲存組織樣本。氣相液氮罐是在液氮容器中加入一定量液氮，樣本儲存在容器中不與液氮直接接觸的空間。液氮容器內氣相區間的溫度最低（容器口處）不高于-1400C。較少的樣本量可以使用液氮罐儲存，盡量使用適配凍存盒的液氮罐消耗的液氮量較大一些，但由于其取放樣品的便捷以及樣品不易落入液氮罐的特點，越來越多的液氮罐用戶采用了這類配置。大量的樣本對取放的便捷性及液氮加注自動化要求更高，目前主要使用液氮儲存箱。通常需要液氮自動檢測設備和自動加注設備，包括液氮供應罐、液氮塔和液氮管道等。

⑶-196度凍存設備（液氮罐和液氮儲存箱）：液氮罐能使樣本維持在-1960C的低溫，是目前技術條件下所能達到的最佳樣本庫保存溫度。與氣相液氮罐相比液氮液相更易實施，液氮罐內可裝滿液氮，儲存更多的樣本，但對盛裝樣本的凍存管等耗材的要求更高。凍存造血干細胞的血袋可以直接在液氮內儲存，但凍存管不能直接放入液氮內儲存，需要經過處理，要求嚴格的可使用凍存管套對凍存管全身密封，這一方法需要更高的凍存盒和更大間隔的凍存架。簡易方法是可使用密封膜對凍存管管帽和管身接合處密封，一些常用10x10底部間隔的凍存盒即可兼容，不需要特殊的凍存管架。從目前客戶的反應以及文獻來看，這一方法雖然簡易，但效果還比較可靠。

監控設備

監控設備包括冰箱溫度探頭、冰箱運行溫度記錄，液氮罐液位監控、遠程報警、視頻監控等。超低溫冰箱和深冷冰箱都需要實時監控溫度。盡管很多廠家在設備上有溫度測量和數據輸出裝置，不少用戶選擇另行安裝溫度探頭單獨監控溫度。溫度探頭的位置建議放于冰箱溫度最高的底部區域以確保樣品安全。冰箱的運行溫度記錄也是基本的要求。遠程報警系統目前常用手機報警結合網絡報警。溫度探測裝置會將超過正常溫度范圍的警報通過在冰箱等設備中預制的手機SIM卡自動給相關管理人員手機短信實時報警，同時相關信息也會通過互聯網或數據線向管理軟件系統報警。近年來視頻監控逐漸成為很多實驗室的常規配置，除了在走廊、出口等處安置常規攝像頭監控外，在樣品處理、冷凍等關鍵操作環節安置可調焦距的高分辨率攝像頭可以遠程實時監控并記錄操作人員的操作細節是否規范，對加強人員管理保證樣品質量很有幫助。

其它設備

樣本庫通常還需要進行一定的樣品運輸和轉移。-20度樣本轉移一般用冷凝膠包（Gel pack），-700C用干冰，-1500C以下用液氮運輸罐。為避免包裹遞送因意外原因延誤，樣本包裝里需要配備至少24小時的制冷劑余量。凍存管架直接影響容器樣本存儲能力，需要根凍存設備、耗材的類型具體選用或定制。樣本量特別大的庫還可能用到自動化存取設備，這一方案目前只和-800C設備配套使用，需要使用特定的管理軟件凍存設備。

所有來源于人的樣本都被認為是具有潛在感染性和有害的，必須經過相關病原體檢驗和相應處理才能入庫。樣品處理必須在生物安全柜內進行。生物安全柜能實現對樣本潔凈性以及操作者和環境的同時保護，但超凈臺的風是由里到外吹的，只能保護樣本的潔凈性，不能保護操作者和環境免受潛在病原體的危害。

凍存耗材

與普通實驗室相比，樣本庫的樣品保存時間更長，對樣本中各種成份穩定性和完整性的保護要求更嚴格，使用數量更大，因此對耗材的性能特點及規格挑選有更高的要求。

目前樣本庫常用的樣本存儲耗材是1~5 ml的凍存管，其中2 ml的凍存管是最常用，有些廠家把實際容量2 ml和5 ml的凍存管分別標稱為1.8 ml和4.5 ml的工作容量以提醒使用者不要裝滿，防止液體冷凍是體積增加破壞密封性。除了常規單個使用的凍存管，還有一些按96孔板大小整版存放的凍存管，使用專門設計的形狀和管蓋，以便使用自動化機械手臂操作。

由于聚丙烯（Polypropylene, PP）能夠耐受低溫（-1960C），具有相對較低的液氮滲透性和較好的化學試劑耐受性（如DMSO），因此聚丙烯被最為普遍的用于制作凍存管。凍存管作為生物樣本儲存過程中直接與樣品接觸的物質，其原材料的可靠性級別也直接影響了所裝載物質的安全性。聚丙烯材料的級別可基本從四個方面去判斷：純凈性、無菌性、化學耐受性和對生物分子（細胞、蛋白、RNA和DNA等）的吸附性。

美國藥典（USP）將塑料等級分為6級，其中6級塑料需進行多項與細胞接觸性反應測試，以確保其對細胞的毒性最低，可用于醫療器械產品的制備。因此在樣本儲存中建議盡量選用的塑料凍存管為超純醫用級原始樹脂，并能通過USP Class VI的測試。長期儲存過程中凍存管材對生物大分子的吸附性是十分重要的考慮因素。對血樣，尤其是提純的微量生物大分子樣本來說，普通的塑料管材容易在長期儲存中因吸附而造成樣本內某些生物大分子濃度降低，破壞樣本的完整性。因此樣本庫中建議使用專用的性能可靠的凍存管，不建議使用微量離心管等非專用耗材。另外為了更好地長期保持密封性，美國國家腫瘤協會組織庫建議使用帶有螺紋密封的凍存管，不建議使用插拔式或者彈出蓋子式的耗材。凍存管的螺旋有內旋和外旋之分，外旋是為超低溫冰箱設計的，內旋是為更低的溫度比如液氮氣相或深冷冰箱設計的。但液氮內直接存放凍存管需要對凍存管進行進一步的防護，以免液氮泄露。液氮泄露進凍存管不僅容易造成凍存管在化凍時爆炸破壞樣品并危及操作者，更嚴重的后果是造成樣本間交叉感染。凍存管的無菌程度也是一個重要指標，尤其是對于將來可能用于臨床使用的樣本，盡可能滿足或者接近2010年新版中國藥典對耗材的要求（SAL 10-6）。

對于一些體積較大的樣本，目前市面上Nalgene有一款15ml的廣口無菌凍存管可用于5-15ml的液體或者較大的組織器官儲存。更大的液體體積可以使用血袋。廣口無菌凍存管和血袋能夠耐受-1960C低溫。

樣本管理信息化

普通實驗室手寫標記的凍存管已經很難滿足樣本庫的大容量凍存需求。一種常見的解決方案是現場編輯并打印一維或者二維編碼及樣本信息，然后手工粘貼到普通凍存管上。另一種解決方案是選擇廠家激光蝕刻了二維編碼的凍存管。從編碼的識別性和牢固度等多種角度比較兩種方案，后一種方案在實際應用的優點是顯而易見的，也是目前發展的方向。預設二維碼的耗材成本整體來看高于現場打印編碼方案，但打印編碼的方案對標簽紙張、打印質量、粘合劑都有特殊的要求，需要耐受長期低溫儲存及一定的濕度，普通打印紙和普通油墨容易發生標簽脫落、字跡模糊和油墨成本如鉛等污染樣本。這些額外的成本甚至能和普通凍存管價格相當，需要在做預算的時候加以充分考慮。紙質的凍存盒是普通實驗室早期使用的凍存盒，近年來已經被聚碳酸酯的凍存盒替代，尤其是在-1400C以下的溫度。樣本庫對穩定性可靠性的要求比一般實驗室更高，建議使用聚碳酸酯的凍存盒，有些聚碳酸酯的凍存盒在需要的情況下還可以高溫高壓滅菌。有些標準尺寸的聚碳酸酯凍存盒使用底部柱形間隔可以放置10x10個2 ml或2 ml 以下外旋或者內旋凍存管。同樣外部尺寸的紙質凍存盒的間隔設計通常只能放置9X9個2 ml外旋或內旋凍存管。

在樣本庫潛在樣本容量較大的情況下，需要使用二維編碼，這時預制二維編碼就體現出了難以替代的優點。首先紙質標簽上打印的二維編碼經過長期冷凍之后識別率比較低，因此目前使用的一維和二維混合打印編碼的標簽實際上主要還是依賴一位編碼提供可靠識別。其次預制二維編碼管能夠實現快速讀碼，更能滿足樣本庫高通量需求。預制二維碼的凍存管采用96孔板的儲存格式（SBS footprint），可使用自動化讀碼儀一次性從底部讀取整板上所有的凍存管，從而盡量減少取樣時間，降低讀碼取樣過程中樣品升溫造成的傷害。

由于不同的樣本庫在編碼讀碼設備、監控設備、冷凍設備、耗材、樣本容量等方面有較大的差異，管理軟件通常是根據用戶的具體配置和要求量身定做的，有些情況下還需要與實驗室其他管理軟件整合，并在后期的使用中根據需求和反饋進一步改進。由于管理軟件、設備及耗材編碼設備為一個整體系統，所以在選擇軟件時應考慮系統兼容性。軟件對監控設備、報警設備的整合、界面友好程度、可擴展性和穩定性也都是重要考慮因素。另外管理軟件中對樣本信息需要設置管理權限以保證樣本來源的隱私。管理軟件有設備/耗材廠家配套提供的，第三方軟件公司提供的，也有樣本庫根據自己的需求自行制作。

疾病生物樣本數據庫作為大數據時代重要的資源，對疾病的發生、發展、轉歸以及治療的研究意義重大。實現樣本庫的質量管理、信息數據結構化與標準化數據共享將是大數據時代樣本庫建設的三項關鍵任務。其中，疾病生物樣本及其信息的質量管理將決定并影響研究的結果。因此，實現疾病生物樣本的質量管理制度以及相關質量檢測方法，實現樣本庫質量的持續改進，將有助于疾病研究的發展。